作者：Ying Tan, Quan Sheng Zhang（張全勝，通訊作者）, Wei Zhao, Zhe Liu, Ming Yu Ma, Ming Yu Zhong, Meng Xin Wang（煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院）

時(shí)間：2019年7月25日

期刊：Photosynthesis Research

英文標(biāo)題：The highly efficient NDH?dependent photosystem I cyclic electron flow pathway in the marine angiosperm Zostera marina

關(guān)鍵字：環(huán)式電子傳遞、NADPH脫氫酶復(fù)合體、放氧復(fù)合體、跨膜質(zhì)子梯度、大葉藻

過(guò)量輻射引起的光合器官的光氧化損傷是影響陸生和海生植物的主要脅迫因子之一。光氧化損傷會(huì)破壞ATP和NADPH產(chǎn)生的化學(xué)計(jì)量平衡，植物必須對(duì)ATP和NADPH進(jìn)行非常精確的動(dòng)態(tài)控制，以維持高效的光合作用，滿足植物不同的代謝需求。通過(guò)調(diào)整線性電子(LEF)到光系統(tǒng)I循環(huán)電子 (PSI-CEF)的速率，ATP /NADPH比值可以被靈活地調(diào)整到所需的水平。當(dāng)由兩個(gè)光系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的LEF從水到NADP+時(shí)，O2在氧進(jìn)化復(fù)合體(OEC)發(fā)生進(jìn)化，同時(shí)產(chǎn)生NADPH和ATP。作為一種補(bǔ)充機(jī)制，PSI-CEF催化電子從PSI受體轉(zhuǎn)移到質(zhì)體醌(PQ)，使光化學(xué)激發(fā)的電子通過(guò)cytb6f復(fù)合物和PC返回到PSI，而不需要凈生成任何基質(zhì)還原劑。在這個(gè)過(guò)程中，質(zhì)子被從基質(zhì)中取出并泵入到類(lèi)囊體腔，產(chǎn)生了跨類(lèi)囊體的質(zhì)子梯度(△pH)，并通過(guò)CF0F1-ATP合酶通道驅(qū)動(dòng)ATP合成。因此，PSI-CEF的活性被認(rèn)為有助于平衡由光反應(yīng)產(chǎn)生的ATP/NADPH的比例。

在被子植物中至少提出了兩種備選的PSI-CEF通路。主要途徑是涉及質(zhì)子梯度調(diào)節(jié)5 (PGR5)和類(lèi)PGR5光合顯型1 (PGRL1)的抗霉素a敏感途徑。次要途徑是由對(duì)魚(yú)藤酮敏感的葉綠體NADPH脫氫樣(NDH)復(fù)合物介導(dǎo)的。擬南芥突變體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PGR5/L1和NDH依賴的循環(huán)電子傳遞對(duì)跨類(lèi)囊體膜質(zhì)子梯度分別貢獻(xiàn)30%和5%。葉綠體NDH復(fù)合體是位于類(lèi)囊體基質(zhì)中的一種多蛋白復(fù)合體，最初是通過(guò)與線粒體呼吸電子傳遞中的復(fù)合體I同源而發(fā)現(xiàn)的。迄今為止，在葉綠體NDH復(fù)合體中共檢測(cè)到29個(gè)亞基，其中包括五個(gè)亞復(fù)合體:膜亞復(fù)合體、亞復(fù)合體A、亞復(fù)合體B、腔內(nèi)亞復(fù)合體和電子供體結(jié)合亞復(fù)合體。葉綠體NDH復(fù)合體缺乏氧化NAD(P)H的亞基，但有與Fd位點(diǎn)鏈接的供體連接亞復(fù)合體，NAD(P)H將電子經(jīng)Fd傳遞給NDH復(fù)合體繼而還原PQ庫(kù)。

目前提出了依賴NDH的PSI-CEF的三個(gè)主要功能：(1)通過(guò)下調(diào)通過(guò)cytb6/f復(fù)合物的電子輸運(yùn)以酸化類(lèi)囊體腔來(lái)啟動(dòng)光保護(hù)，并在PSII中誘導(dǎo)非光化學(xué)猝滅的qE組分來(lái)消散吸收的多余光能；(2)在各種嚴(yán)重脅迫條件下，通過(guò)保持ATP/NADPH的高輸出比來(lái)保護(hù)光合器官免受基質(zhì)過(guò)度還原的傷害；(3)產(chǎn)生額外的ATP來(lái)驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)修復(fù)，滿足植物的各種代謝需求。然而，葉綠體NDH復(fù)合體的生理功能可能因物種、處理?xiàng)l件、生長(zhǎng)環(huán)境等有所不同。已有研究表明，NDH依賴的PSI-CEF損傷不影響整體光合作用，說(shuō)明NDH依賴的PSI-CEF在穩(wěn)態(tài)光合作用中不是必需的，雖然它在波動(dòng)環(huán)境下的光合調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。一般認(rèn)為NDH依賴的PSI-CEF不參與弱光條件下的光合作用，但最近的一項(xiàng)研究表明，水稻的NDH復(fù)合體缺失可以在弱光條件下降低碳同化速率和植物生物量積累。絕大多數(shù)的海洋植物(Peltier和Cournac 2002)，以及一些陸生高等植物，如所有種類(lèi)的球根植物和松科植物，以及部分種類(lèi)的蘭科和天竺葵科植物，均未檢測(cè)到NDH基因編碼。缺乏NDH復(fù)合體，表明該復(fù)合體的功能可有可無(wú)，可能存在一些替代或補(bǔ)償?shù)碾娮觽鬟f途徑彌補(bǔ)其功能。相反，NDH復(fù)合體在某些物種中的存在可能提供一個(gè)關(guān)鍵的選擇優(yōu)勢(shì)，使光合反應(yīng)能夠適應(yīng)環(huán)境壓力。大多數(shù)海洋植物的NDH復(fù)合體的缺失可能與它們相對(duì)穩(wěn)定的海洋棲息地有關(guān)。

大葉藻屬(Zostera marina, Zosteraceae)，又稱eelgrass，是一種廣泛分布的海草物種，由陸地單角類(lèi)的淡水祖先進(jìn)化而來(lái)，并成功地過(guò)渡到完全淹沒(méi)的海洋分類(lèi)單元。在進(jìn)化過(guò)程中，基因組的缺失和擴(kuò)增現(xiàn)象頻繁發(fā)生，為其海洋生活方式所需的結(jié)構(gòu)和生理適應(yīng)提供了遺傳變異。根據(jù)氨基酸序列的多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大葉藻具有完整的29個(gè)編碼葉綠體NDH亞基的基因，即使在海洋被子植物中也很少見(jiàn)。分類(lèi)與大葉藻同目的波喜蕩草屬（Posidonia）和根枝草屬（Amphibolis）未檢測(cè)到編碼葉綠體NDH復(fù)合體的基因。因此，葉綠體NDH復(fù)合體在Z. marina的作用需要探索。在本文中，我們提出了在Z. marina中高效的NDH依賴的PSI-CEF，這可能與OEC失活以及光合性能的維持有關(guān)。此外，我們提供的證據(jù)表明，在過(guò)量輻照下依賴NDH和依賴PGR5/Li的PSI-CEF之間存在此消彼長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)變化。

—— 材料和方法 ——

植物材料

在位于中國(guó)山東半島北側(cè)的榮成(37°16′N(xiāo), 122°41′E)3 m深度的次潮汐海草床上采集到根莖系統(tǒng)完整(6-9節(jié)間)的健康大葉藻。在2019年5月連續(xù)幾天的下午晚些時(shí)候進(jìn)行采樣。大葉藻在實(shí)驗(yàn)前在過(guò)濾海水水族館預(yù)培養(yǎng)3天，在15℃和100μmolm-2s-1，以10:14-h的光：暗周期進(jìn)行照明。根據(jù)最小飽和光強(qiáng)度，照明由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。從葉鞘上方2厘米處采集葉片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)量，以保持相同的年齡。

進(jìn)化分析

基于29個(gè)NDH亞單位的串聯(lián)序列，采用MEGA 5.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行了1000次重復(fù)的bootstrap測(cè)試。這30個(gè)物種的所有這些序列都是通過(guò)BLASTP分析從國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)檢索到的。交互式生命樹(shù)(https:// url .embl.de/)用于對(duì)樹(shù)進(jìn)行注釋和修飾。

光處理和抑制劑處理

暗適應(yīng)過(guò)夜的大葉藻暴露在三種不同的光強(qiáng)度，50,300和600μmolm-2s - 1反應(yīng)3小時(shí)。這些處理在下文稱為弱光（LL）、中光（ML）和強(qiáng)光（HL），它們通過(guò)德國(guó)DUAL-PAM-100來(lái)測(cè)量最小飽和光強(qiáng)來(lái)確定。所有處理均在光照培養(yǎng)箱(GZP-250N，上海森欣實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)中進(jìn)行，控制海水溫度為15℃，模擬其在自然環(huán)境中的生長(zhǎng)狀態(tài)。光由A型LED燈提供，色溫范圍6000 K。在測(cè)定熒光動(dòng)力學(xué)之前，隨機(jī)選取暴露于光照下的葉片，每隔20分鐘至暗適應(yīng)15分鐘。Antimycin A (AA, Sigma)和rotenone (Aldrich)分別用于抑制PGR5/L1和NDH依賴的PSI-CEF。分別以甲醇和二甲亞砜為溶劑，制備了AA和魚(yú)藤酮原液。處理后樣品的溶劑濃度低于1% (v/v)。葉片使用過(guò)濾海水或含1μM AA, 150μM魚(yú)藤酮的海水進(jìn)行飽和，并在光處理之前，在15℃的黑暗條件下孵育葉片1 h。

葉綠素A熒光和P700測(cè)定

利用DUAL-PAM-100測(cè)量系統(tǒng)同時(shí)測(cè)量葉綠素a熒光和P700+吸光度變化。在微弱的調(diào)制光下（5μmol m-2s-1）測(cè)量出最小熒光值（Fo）后，分別對(duì)暗適應(yīng)和光適應(yīng)條件下的葉片在300ms的飽和脈沖光下（16000μmol m-2 s-1）測(cè)量Fm和Fm’。Fs是光照條件下的穩(wěn)態(tài)熒光值。P700+的信號(hào)會(huì)在最?。ㄍ耆€原）和最大（完全氧化）之間變化。最大的變化在P700完全氧化狀態(tài)(Pm)和一個(gè)給定的光狀態(tài)(Pm’)是在遠(yuǎn)紅光(250μmol m? 2 s?1)和光化光（127μmol m? 2 s?1）預(yù)照射后由飽和脈沖光測(cè)量。PSII的最大光量子產(chǎn)量：Fv/Fm = (Fm ? Fo)/Fm，PSII的電子傳遞速率：ETRII = 0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Fm’—Fs)∕Fm’，PSI的電子傳遞速率：0.84 × PPDF × 0.5 ×( -Pm’—P)/Pm，PSI-CEF：ETRI-ETRII。

暗適應(yīng)樣品在光化光下照射2min，在關(guān)閉AL后，我們監(jiān)測(cè)了隨后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)增加作為NDH活性的一個(gè)指標(biāo)，關(guān)閉AL后10 s內(nèi)測(cè)定鼓包的初始斜率。根據(jù)Li等人的方法，在暗適應(yīng)葉片中，當(dāng)光誘導(dǎo)吸光度在830nm處發(fā)生變化時(shí)，監(jiān)測(cè)P700+的還原動(dòng)力學(xué)。我們測(cè)量P700的再次還原之前采用一個(gè)專用校準(zhǔn)程序?qū)700信號(hào)進(jìn)行歸一化處理。遠(yuǎn)紅光照射后10 s內(nèi)測(cè)定P700+再還原半衰期縮短(t1/2)，表明PSI-CEF活性升高。

快速OJIP熒光瞬態(tài)測(cè)量

利用多功能植物效率分析法測(cè)定葉綠素?zé)晒饪焖僬T導(dǎo)曲線。由曲線得到如下數(shù)據(jù)：20 μs的最小熒光值（Fo），最大熒光值（Fm），0.3ms的熒光值（K-step，F(xiàn)k），3ms的熒光值（J-step，F(xiàn)j），30ms的熒光值（I-step，F(xiàn)i）。為了評(píng)價(jià)PSII的活性，計(jì)算了PSII從光子吸收到系統(tǒng)間電子受體減少的能量守恒性能指數(shù)(勢(shì))：PIABS=4 ×(Fk ? Fo) × Fm × (Fm ? FJ)/Fv × (FJ ? Fo)2，作為PSII供體側(cè)指標(biāo)監(jiān)測(cè)的k步歸一化可變熒光被計(jì)算為WK = (Fk?Fo)/(FJ?Fo)。

ECS分析

電致變色效應(yīng)吸光度信號(hào)變化的測(cè)量是用DUAL-PAM-100的P515/535模塊在515nm波長(zhǎng)下進(jìn)行監(jiān)測(cè)。樣品先暗適應(yīng)15min，再在127μmolm-2s-1的光化光下照射5min，然后再進(jìn)行測(cè)量。AL被關(guān)閉，記錄ECS的衰變動(dòng)力學(xué)，以確定總ECS，代表了總質(zhì)子動(dòng)能(pmf)的大小及其組成部分，即ΔpH和Δψ。ECS衰減(gH+)是通過(guò)最初的300ms響應(yīng)速率到P515發(fā)射結(jié)束來(lái)估計(jì)的。

免疫印跡分析

從處理的葉片中分離出葉綠體按照是廠家的指導(dǎo)使用Plants Leaf Chloroplast Rude Divide Kit測(cè)量。葉綠素含量測(cè)定采用Porra等人的方法。根據(jù)Towbin等人的描述，對(duì)NdhH、NdhS、PGR5、PGRL1、PsbO、PsbP和PsbQ(Agrisera，瑞典)的抗體進(jìn)行Westernblot分析。采用Rubisco大亞單位抗體(RbcL, Agrisera，瑞典)作為內(nèi)參對(duì)照。用凝膠對(duì)x射線膠片上產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光帶進(jìn)行密度測(cè)量使用圖像實(shí)驗(yàn)室軟件對(duì)Doc XR+系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進(jìn)行量化。每個(gè)目標(biāo)條帶的總密度都是基于RbcL密度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的。

數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有參數(shù)均采用單因素方差分析。采用Tukey趨勢(shì)檢驗(yàn)進(jìn)行事后比較。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P < 0.05。使用Origin9.0程序，采用單指數(shù)函數(shù)擬合法對(duì)P700+再還原的每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行擬合。使用線性回歸分析來(lái)評(píng)估WK，PIABS，和鼓包。

—— 結(jié)果 ——

NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生分析

基于連接的29個(gè)NDH亞基序列構(gòu)建了葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，顯示了NDH復(fù)合序列在藍(lán)藻、苔蘚、蕨類(lèi)、蕨類(lèi)和石生植物中NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在藍(lán)藻門(mén)，輪藻門(mén)和蕨類(lèi)植物NDH復(fù)合物均不完整，并且部分被子植物中也缺失部分NDH亞基的。Z.marina包含五個(gè)完整的NDH亞復(fù)合物。海洋植物中除了原始藻類(lèi)之外，綠藻、硅藻、紅藻和褐藻等常見(jiàn)藻類(lèi)都缺少編碼葉綠體NDH復(fù)合體亞基的同源基因，這表明Z. marina中NDH復(fù)合體的存在可能在光合作用中發(fā)揮重要作用。

圖1 葉綠體NDH復(fù)合體的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

PSI循環(huán)電子流的動(dòng)態(tài)變化

以ETRI-ERTII為代表的PSI-CEF的活性在三個(gè)水平的照射下逐漸增加。同樣，P700+再誘導(dǎo)所示的PSI-CEF活性也隨著光強(qiáng)的升高而逐漸升高。這些結(jié)果表明，大葉藻PSI-CEF隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，同時(shí)也會(huì)隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)而增強(qiáng)。

圖2 在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理?xiàng)l件下ETRI-ETRII隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。采用Tukey趨勢(shì)檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)

圖3 a在LL（50μmolm-2s – 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）處理?xiàng)l件下P700+再還原半衰期隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。每個(gè)點(diǎn)表示對(duì)指數(shù)函數(shù)的擬合（所有R2值＞0.96）

兩個(gè)PSI循環(huán)電子途徑的動(dòng)態(tài)變化

利用光照后葉綠素?zé)晒獾乃矔r(shí)增強(qiáng)來(lái)測(cè)定NDH依賴的PSI-CEF。如圖4a所示，葉綠素?zé)晒庠诠庹蘸蟪霈F(xiàn)了明顯的瞬時(shí)增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)在HL條件下大于ML大于LL光照處理。此外，光照后的初始斜率隨著曝光時(shí)間的增加而逐漸增大(圖4c)，說(shuō)明NDH依賴的PSI-CEF被顯著激活。為了確定處理過(guò)量照射的兩個(gè)PSI-CEF通路的持續(xù)響應(yīng)，我們使用從Z. marina葉子中分離的葉綠體，使用特異性抗體進(jìn)行免疫印跡分析。針對(duì)NdhH亞基的抗體只能識(shí)別45kDa的一個(gè)多肽，而抗NdhS的抗體只能識(shí)別27-kda的一個(gè)蛋白。每個(gè)樣本中，anti-PGR5識(shí)別一個(gè)15-kda蛋白，anti-PGRL1識(shí)別一個(gè)29-kda蛋白（圖5）。光密度分析顯示，NdhH和NdhS蛋白水平所描述的ndh依賴通路活性明顯隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。相比之下，由PGR5和PGRL1蛋白水平表達(dá)的PGR5/L1相關(guān)的通路活性在光照開(kāi)始后的早期最高，隨后下降到穩(wěn)定水平(圖5b)，表明PGR5 /l1依賴和nndh依賴的PSI-CEF通路可能在不同的光照期交替作用。

圖4 a一種監(jiān)測(cè)NDH活性的經(jīng)典葉綠素?zé)晒庾粉?，b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下照射3h后鼓包的響應(yīng)。b在LL（50μmolm-2 s– 1 黑色圓形）、ML（300μmolm-2s – 1 黑色方形）、HL（600μmolm-2s – 1 黑色三角）條件下鼓包的初始斜率隨時(shí)間的變化過(guò)程。平均值±SD由四個(gè)獨(dú)立樣本計(jì)算。采用T檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)